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β-葡聚糖检测

来源:发布时间:2017-03-07

  

  1范围
  本标准规定了谷物及其制品中β-葡聚糖含量的酶一比色测定方法。
  本标准适用于燕麦、大麦、青稞、黑麦等谷物及其加工制品(面粉、麸皮、麦片、饮料等)中β-葡聚糖 含量的测定。
  2规范性引用文件
  下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
  GB 5009.3食品安全国家标准食品中水分的测定 GB/T 5491粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
  3原理
  该法利用地衣聚糖酶(或称葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶对样品中(1—3) (1-4)-β-D -葡聚糖(混联 β _ D -葡聚糖,或简称β-葡聚糖)的酶解作用,由地衣聚糖酶专一性地水解p -葡聚糖成寡糖,β-葡萄糖 苷酶则将寡糖水解成葡萄糖;葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢,过氧化氢在过氧 化物酶作用下,与4-氨基安替比林氧化缩合生成红色醌类化合物。此化合物在510 nm有吸收,其吸光 度值与葡萄糖含量成正比。
  4试剂
  除非另有说明,在分析中仅使用经确认的分析纯试剂,实验用水应符合GB/T 6682中三级水的要求。
  4.1  50 U/mL地衣聚糖酶溶液
  将1 mL地衣聚糖酶溶液(1 000 U/mL)用磷酸钠缓冲液(20 mmol/L、pH6. 5)稀释至20. 0 mL,把酶液等分成4份,每份5置于聚丙烯塑料瓶中,在一 20°C下冷冻保存,备用。【注:地衣聚糖酶活力单位定义为:在pH6. 5、40°C条件下,每分钟从大麦(3-葡聚糖(10 mg/mL)中释放出相当于1 /iimol/L葡 萄糖还原糖当量所需的酶量,即为1 U。】
  4.2  2 U/mL p-葡萄糖苷酶溶液
  将1 mLβ-葡萄糖苷酶溶液(40 U/mL)用乙酸钠缓冲液(50 mmol/L、pH4. 0)稀释至20 mL,把酶液 等分成4份,每份5 mL,置于聚丙烯塑料瓶中,在一 20°C下冷冻保存,备用。【注:β-葡萄糖苷酶活力单 位定义为:在pH4.0、40°C条件下,每分钟从对-硝基苯基-β-葡萄糖苷(10 mmol)中释放出相当于 1 pmol/L对-硝基苯酚所需的酶量,即为1 U。】
  4. 3葡萄糖氧化酶一过氧化物酶一缓冲液混合物
  内含葡萄糖氧化酶(>12000VL)、过氧化物酶(>650 IV L)、4 -氨基安替比林(0. 4 mmol/L)。
  注:葡萄糖氧化酶活力单位定义为:在pH5. 1、35°C条件下,每分钟氧化1 mmol葡萄糖所需的酶量,即为1 U;过氧化 物酶活力单位定义为:在pH6. 0、20°C条件下,20 s内使焦性没食子酸生成1. 0 mg红掊酚所需的酶量,即为1 U。 缓冲液的配制:称取13. 6 g KH2P04、4. 2 g NaOH和3. 0 g 4 -羟基苯甲酸,溶于水中,调节pH7. 4, 定容至100 mL。
  葡萄糖氧化酶一过氧化物酶一缓冲液混合物的配制:取50 mL缓冲液稀释至1 000 mL;用该稀释 缓冲液溶解葡萄糖氧化酶一过氧化物酶混合试剂,使之达到所需浓度。该混合试剂在4°C下可稳定存 放2个〜3个月,一20°C下可稳定存放2年〜3年,与葡萄糖反应所形成的颜色可稳定数小时。
  4.4  50%乙醇溶液
  4. 5 20 iranol/L、pH6. 5磷酸钠缓冲液
  称取3.12gNaH2P04.2H2〇,加900mL水溶解;调节pH6.5,定容至l000mL。该缓冲液在4°C 下可存放一个月。
  4.6乙酸钠缓冲液
  4. 6. 1  200 mmol/L、pH4. 0乙酸钠缓冲液:取7. 6 mL冰醋酸于900 mL水中,加入4. 8 g三水乙酸钠,溶解;调节PH4. 0,定容至1 000 mL。
  4.6.2 50 mmol/L、pH4.0乙酸钠缓冲液:取250 mL 200 mmol/L、pH4.0乙酸钠缓冲液稀释至1 000 mL。
  4. 7 1. 000 mg/mL葡萄糖标准存溶液将葡萄糖粉末(纯度大于99%)于100°C下常压干燥2 h;置于干燥器中冷却,室温下密闭保存。准 确称取0• 1000 g干燥葡萄糖,用50 mmol/L、pH4. 0乙酸钠缓冲液(4. 6. 2)溶解并定容至100 mL。该 标准溶液在4°C下可存放一个月。
  注:其中4. 1、4. 2、4. 3涉及酶制剂均可由Megazyme混联p _ D _葡聚糖测定试剂盒提供。Megazyme是爱尔兰 Megazyme公司产品的商品名,给出这一信息是为了方便本标准的使用者。如果还有其他产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。
  5仪器和设备
  5. 1旋风磨或粉碎机:样品粉碎后可过0.5 mm或35目筛网。
  5. 2离心机:能容纳15 mmX 100 mm或10 mmX 75 mm的玻璃试管,离心力1 000Xg。
  5.3水浴锅:温度稳定性±〇.2°C。
  5.4旋涡混合仪。
  5.5  pH 计:精度 0.01。
  5.6分析天平:感量0.0001 g。
  5.7干燥箱:可保持i〇5°c 士 1°C。
  5.8分光光度计:检测波长510 nm。
  5. 9比色皿。
  5. 10 移液器:量程 10 jllL〜100 /iL、20 /xL〜200 jmL、l 000  〜5 000 jliL,配备一^次性吸头。
  5. 11 容量瓶:容积 100 mL、l 000 mL。
  5. 12具塞玻璃试管:容积15mL〜20mL,可于1 000Xg下离心。
  5. 13试管架:30孔或40孔,能放置15 mL〜20 mL具塞玻璃试管。
  5. 14计时器(秒表)。 6试样制备
  6.1待测样品按照GB/T 5491的规定取样。
  粉末状样品:取50 g以上,充分混匀后于广口瓶中密闭保存。颗粒或片状样品:取50 g以上,使用粉碎机(5.1)粉碎,混匀后于广口瓶中密闭保存。
  液体样品:取200 mL以上,混匀后于试剂瓶中密闭保存。固体样品中水分含量或液体样品中干物质含量的测定可参照GB 5009. 3规定的方法执行。
  6.2葡萄糖标准工作液平行移取100 l^L葡萄糖标准贮存溶液(4. 7)至3支试管中,分别添加100  - 50 mmol/L乙酸钠缓冲液(4. 6. 2)。
  6.3试剂空白移取200  -50 mmol/L乙酸钠缓冲液(4. 6. 2)至试管中。
  7分析步骤
  在样品测定时,需同时进行葡萄糖标准工作液(3个平行)的测定,分光光度计用试剂空白调零。必 要时可添加一个已知β-葡聚糖含量的对照样品以检验结果的准确性。
  7.1样品称取 7. 1.1无糖固体样品精确称取待测样品0. 080 0 g〜0.100 0 g,放入玻璃试管底部。
  7. 1.2高含糖固体样品精确称取适量样品至试管中,加入10 mL 50%乙醇溶液(4. 4),80°C预提取10 min;离心(1⑻OXg、 10 min),弃去上清液;将沉淀重复醇洗一次、离心(1 000Xg、10 min),保留沉淀,备用。
  7.1.3液体样品
  移取待测样品1 mL〜5 mL(精确至0• 01 mL),置于玻璃试管(已知重量)底部;添加3倍体积95% (v/v)乙醇溶液,于旋涡混合仪上剧烈振荡混合,室温下放置5 min;离心(1 000Xg、10 min),弃去上清 液;添加10 mL 50%乙醇溶液(4. 4)将沉淀再次分散;离心(1⑻0Xg、10 min),弃去上清液,保留沉淀, 备用。
  注:此步骤需称取含沉淀试管质量,减去试管质量和待测样品干物质质量,可得样品吸水量,记人样品反应总体积。 7.2酶解前处理
  7. 2.1向待测样品试管中添加0. 2 mL 50%乙醇溶液(4. 4),于旋涡混合仪上振荡分散;加入4. 0 mL 磷酸钠缓冲液(4. 5),充分振荡。
  7. 2. 2将试管放人沸水浴中,保持1 min;取出试管,在旋涡混合仪上剧烈振荡数秒;沸水浴中继续保持 2 min,振荡处理同前。
  7.3酶解反应
  7. 3. 1试管在50°C水浴中保温5 min,添加0. 2 mL地衣聚糖酶溶液(4.1),剧烈振荡数秒;加盖试管 塞,50°C水浴继续保温60 min;其间将试管取出,振荡处理3次〜4次。
  7. 3.2取出试管,向其中添加5 mL 200 mmol/L乙酸钠缓冲液(4. 6. 1),混合均匀,室温下冷却5 min〜 10 min;离心(1 000Xg、10 min),取上清液,备用。
  7. 3. 3分别准确移取0. 1 mL上清液至3支试管的底部,向其中2支试管中分别添加0. 1 mLp -葡萄糖 苷酶溶液(4. 2) •,另一支试管中添加0. 1 mL 50 mmol/L乙酸钠缓冲液(4. 6. 2),作为反应空白,将上述 试管在50°0下保温101^11。
  7. 4显色反应
  分别移取3. 0 mL葡萄糖氧化酶一过氧化物酶一缓冲液混合物(4. 3)至各试管(包括2个测试样、1 个反应空白、3个D-葡萄糖标准工作溶液、1个试剂空白),50°C下反应20 min;取出试管,冷却至室温。 7.5比色以试剂空白调零,于510 nm处测定吸光值。如果试样中β-葡聚糖的浓度大于10%,将产生比100 ptg葡萄糖标准工作溶液高的吸光度。此时,需在步骤7. 3. 2之后,取适量50 mmol/L乙酸缓冲液(4. 6. 2)稀释上清液,然后继续7. 3. 3以下步骤, 结果计算时应把稀释因子考虑在内。
  8结果计算 8.1固体样品
  样品湿基中葡聚糖的质量百分含量按式⑴计算:葡聚糖含量(%,湿基)=MXFX94X10—6xf X0.9 ..........................................  (1)式中:
  M——样品吸光值与反应空白吸光值的差值;
  F—一吸光值转化为葡萄糖的转换因子,F=100 葡萄糖/100 jug葡萄糖的吸光值;
  94--- 体积校正因子(从9. 4 mL取0. 1 mL用于分析);
  W——固体样品质量,单位为克(g);
  0.9——葡萄糖转化为β-葡聚糖的脱水转换因子。
  样品干基中P _葡聚糖的质量百分含量(%,Ww),按式⑵计算:葡聚糖含量(%,干基)=X 100................................................................................ (2)
  8.2液体样品
  样品中p-葡聚糖的质量体积百分含量按式⑶计算:(3-葡聚糖含量(%) =MXFXCX10-6 X0.9 ........................................  (3)式中:C——体积校正因子(由参与酶解的样品总反应体积6nL)除以用于分析的0. 1 mL得到);
  V液体样品体积,单位为毫升(mL)。
  其他定义同8.1。
  以上计算结果保留小数点后二位。
  9精密度 9.1重复性
  在重复性条件下测试结果的相对标准偏差(RSDJ不超过5%。
  9.2再现性
  在再现性条件下测试结果的相对标准偏差(RSDr )不超过10 %。